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          新型冠狀病毒的高效檢測方法

          發布日期:2020年02月17日   瀏覽次數7797

          自2020年開始,新型冠狀病毒肺炎的疫情就一直牽動著億萬人的心。截至2月11日8:29,全國已確診病例累計42708例,疑似21675例,疫情防控形勢依然嚴峻。


          新型冠狀病毒傳播方式多樣,除了經呼吸道飛沫和接觸傳播的主要途徑外,目前已有報道病毒還可以經由氣溶膠、消化道、母嬰等不同方式傳播,傳播渠道多,傳染力強。因此,控制nCov病毒傳播比SARS等以往冠狀病毒傳播更加困難,也是目前感染率居高不下的重要原因之一,早發現,早隔離,早確診,早治療是本次疫情防控的重中之重。


          根據國家發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(第五版)》,“疑似”和“確診”的含義是:


          由此可見,除了及早發現臨床表現異常之外,及早從病原學確診更是疫情防控的重要一環。快速確診不但可以盡早對病人施以對癥的治療方法和藥物、增加病人存活率,更可以減少醫療物資的使用量,提高醫療效率,更有力的控制疫情。


          新型冠狀病毒病原學檢測

          對于病原學檢測,雖然有研究表明CRISPR和免疫方法也可用于病毒檢測,但熒光RT-PCR和基因測序目前仍是唯二被認可的方法。兩者相比,前者無疑有更大的優勢,通常在1小時內即可檢測接近幾十甚至幾百個核酸樣本。所以,當前諸多醫院和醫檢所均采用RT-qPCR的方法,使用官方公布的引物和探針,檢測nCov的N1,N2,N3三個靶標基因檢測和人類RNase P,通過陰性對照、陽性對照和目的基因的Ct值判斷標本中是否含有nCov病毒(Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus, www.cdc.gov)。


          另一方面,確診除了需要速度,更需要精度,要在最大程度避免假陰性的產生。假陰性不但會造成對個體的錯誤判斷,延誤病情,更有可能造成傳染源的遺漏,造成更大規模的傳染。假陰性的產生原因主要有以下幾點:

          1. 樣本采集不當,并未采集到合理位置的標本,病毒含量不能反映真實狀況。

          2. 樣本保存和處理不當,造成處理過程中病毒RNA降解。

          3. 提取效率低,病毒并未完全提取,或提取過程中病毒降解。

          4. 檢測分辨率低,檢測下限過高,導致無法檢出病毒。

          5. 實驗員操作不當。

          由此可見,無論是RT-qPCR檢測步驟,還是檢測之前的病毒核酸提取的步驟,都要最大程度的避免產生假陰性。


          樣本準備


          標準的樣本類型,規范的樣本采集、處理和運輸,是避免假陰性的第一步。雖然已有報道病毒會通過糞口等其他方式傳播,但目前世界衛生組織(WHO)的最新資料表明,呼吸材料(鼻咽和口拭子、痰液、肺泡灌洗液等)和血清樣本是檢測nCov的標準。WHO給出的臨時指導中,樣本類型、采集和儲運的方式如下(Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases):




          核酸提取


          在核酸提取層面,避免假陰性最重要的就是要提高核酸的得率。提高得率的難點有三:1. 上述樣本不屬于培養細胞等簡單醫療樣本,樣本類型多,成分復雜,雜質含量高,對樣本裂解效率有很大影響。2. 病毒含量較低,相應的對提取效率的要求就很高,要求提取得率盡量高,能夠滿足后續檢測的要求。3. 樣本中RNA酶會在提取過程中導致病毒RNA降解。因此,在提取時需選用得率高、純度高的試劑盒。此外,在提取過程中,對操作人員的要求也比較高,在提取之前應進行整體培訓,避免操作錯誤或引入RNA酶等雜質。


          定量檢測


          獲取核酸之后,RT-qPCR檢測nCov病毒核酸也有需要注意的幾點:1. 盡量提高檢測分辨率,能夠檢出低豐度的核酸模板,避免假陰性。2. 盡量提高檢測的準確率,避免非特異性信號造成假陽性。3. 盡量提高檢測穩定性,對于同一核酸樣本的檢測結果平行性好。此外,定量實驗的速度也是整體病毒檢測速度中的決定因素,應選擇操作簡便、速度快的試劑盒進行檢測。


          天根生化科技(北京)有限公司作為中國核酸提取和檢測試劑上游供應的領軍企業,多次為國家病毒性流行病(如手足口病毒、甲型H1N1流感病毒、非洲豬瘟病毒疫情等)的診斷及預防提供幫助。目前天根生化正在持續為全國三十多家檢測單位提供病毒核酸提取、熒光定量檢測試劑以及相關儀器設備。


          病毒基因組RNA提取試劑盒(DP315-R)



          DP315-R擁有獨特的裂解液RL,能夠應對冠狀病毒檢測的各類樣本:血液、血清/血漿、組織、拭子、病毒等,裂解效率高,抗逆性強,還含有保護成分,避免RNA降解。試劑盒中特別配備了Carrier RNA用于充分收集微量RNA,提取得率高,最大限度的捕獲病毒核酸。此外,離心吸附柱中采用的硅基質材料為本公司特有新型材料,高效、專一吸附RNA,可最大限度去除雜質蛋白等,提高收集的核酸純度。


          ? 高效率:快速純化得到高質量病毒RNA,重復性高

          ? 高得率:Carrier RNA收集微量核酸,提取靈敏度高,得率高

          ? 高純度:完全抵抗和去除污染物和抑制劑,方便下游應用

          ? 高安全性:無有機試劑抽提或乙醇沉淀


          探針法一步反轉錄-熒光定量試劑盒(FP314)



          FP314特別為檢測樣本中的微量基因和微量RNA病毒設計。試劑盒集成了反轉錄和熒光定量模塊,一步完成從反轉錄到定量的全部操作,操作簡單、快速。試劑盒中使用的King反轉錄酶和新型抗體修飾的Taq聚合酶均為新型工程酶,模板識別靈敏度高,抗逆性強,特別適合復雜環境中低豐度RNA模板的檢測。本試劑盒是基于探針法設計,配合官方公布的引物和探針,對nCov病毒核酸的檢測具有極高的準確率。


          ? 高效:性能優良的逆轉錄酶和DNA聚合酶保證了極高的反應效率

          ? 靈敏:低至1 ng 的模板也能被準確識別,特別適合低豐度模板

          ? 抗逆:通讀GC含量高,二級結構復雜的RNA模板

          ? 普適:對不同物種來源及雜質較多的RNA模板的適用性高

          地址:北京市海淀區西小口路66號東升科技園(北領地)C7-3 電話:800-990-6057
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